Активация транскрипции.

Группа генов, определяющих вхождение клетки в фазу S, активируется транскрипционным фактором АР-1, представляющим собой комплекс белков — членов семейств Jun и Fos (гены, их кодирующие, — c-Jun и c-Fos — относятся к числу протоонкогенов; буква «с» (от англ. cell) обозначает их клеточное происхождение в отличие от вирусных онкогенов v-Jun и v-Fos). Эти транскрипционные факторы могут взаимодействовать между собой с образованием множества гомо- и гетеродимеров, связывающихся с определенными участками ДНК и стимулирующих синтез РНК на прилежащих к этим участкам генов.

МАР-киназы повышают активность АР-1 двумя способами:

• опосредованным, активируя соответствующие гены;
• прямым, фосфорилируя входящие в их состав сери новые и треониновые остатки.

В результате активации генов продуцируются белки, необходимые для синтеза ДНК и последующего митоза. Некоторые из новообразованных белков, известные как белки раннего ответа, выполняют регуляторные функции: связываясь со специфическими участками ДНК, они активируют прилежащие гены. Другую группу белков составляют ферменты, такие как тимидинкиназа, рибонуклеотидредуктаза, дигидрофолатредуктаза, тимиди-латсинтетаза, орнитиндекарбоксилаза, ДНК-полимеразы, топоизомеразы и множество других, которые имеют непосредственное отношение к синтезу ДНК. Усиливается, кроме того, общий белковый синтез, поскольку при каждом цикте удвоения воспроизводятся все клеточные структуры.

Нормальное прохождение клеткой отдельных фаз клеточного цикта обеспечивается строгой последовательностью и упорядоченностью многочисленных ферментативных процессов. Роль «водителя ритма» при этом играют циклины — белки, закономерным образом сменяющие друг друга на протяжении цикла.

Циклические реакции.

Реализация митогенного сигнала происходит следующим образом. Имеется два семейства белков, «движущих» клеточный цикл — циктин(о>с/ш)-зависимые серин/треониновые протеинкиназы и сами циклины. Последние синтезируются и распадаются в строго определенные моменты цикта, различные для разных циклинов. Имеются три основных их класса: G₁-циклины, необходимые для прохождения G,/S, S-циклины — для прохождения S-фазы и G₂ (митотические) циклины — для вхождения в митоз. Исчезновение циклина из внутриклеточной среды в определенный момент времени столь же важно, как и его появление. Например, в митозе (на границе метафазы и анафазы) один из циклинов быстро деградирует в результате протеолиза, если этого не происходит, то митоз не может завершиться и разделения дочерних клеток не происходит.

Контрольно-пропускные пункты.

Любое стрессорное воздействие (например, отсутствие питательных веществ, гипоксия и особенно повреждение ДНК) блокирует движение клетки по циклу в одном из двух контрольных пунктов (checkpoints). Во время этих остановок активируются механизмы надзора, способные: обнаружить повреждение ДНК; передать сигнал неблагополучия, блокирующий синтез ДНК или митоз; активировать механизмы репарации ДНК. Благодаря этому обеспечивается стабильность генома. Механизм контроля G₁/S блокирует репликацию ДНК и активирует процессы репарации (или индуцирует апоптоз), тогда как до завершения репликации митоз запрещен. Дефекты этих механизмов могут привести к появлению дочерних клеток с поврежденным геномом.

В механизме checkpoint участвуют комплексы Cdk-cyclin и ряд дополнительных белков — КЬ, р53 и др. Их совокупность образует систему «тормозов», не позволяющих клетке делиться в отсутствие адекватных стимулов.

Кодирующие эти белки гены получили название генов-супрессоров. Особое значение этой системы заключается в том, что раковая трансформация клетки возможна только после инактивации генов-супрессоров. Важно при этом иметь в виду, что в соматической клетке существуют по два аллеля каждого из генов, в том числе и генов-супрессоров, и. следовательно, для их инактивации необходимы два независимых события (например, деления одного аллеля и мутация другого). Именно в этом кроется причина того, что «спорадические» опухоли возникают относительно редко (вероятность возникновения в одной клетке нескольких независимых мутаций, причем поражающих один и тот же локус обеих хромосом, относительно невелика), а «семейные» чрезвычайно часты (в «раковых» семействах один из двух наследуемых аллелей того или иного гена-супрессора исходно дефектен). В последнем случае система «тормозов» у всех клеток данного организма держится лишь на одном нормальном аллеле, что резко снижает ее надежность и повышает риск возникновения опухоли. Именно это и происходит при наследственной ретинобластоме и других наследственных заболеваниях.

В механизме контроля фазы клеточного цикла G₁/S участвуют ингибирующие белки, в частности семейство СК I (Cdk inhibitory proteins), состоящее из нескольких членов (р27, рl6, р21), которые продуцируются клеткой в ответ на разные стимулы и блокируют клеточное деление. Таким стимулом является, например, TGFb (transforming gowth factor b), который активирует белок р27. И наоборот, митоген интерлейкин-2 (ИЛ-2) инактивирует р27 и способствует тем самым продвижению клеток в цикле деления. Этот же белок р27 участвует, по-видимому, в феномене контактного ингибирования (блокировке деления клеток при соприкосновении их поверхностей) — характерном свойстве нормальных клеток, отсутствующем у опухолевых клеток.

Сходную роль ингибитора клеточного деления выполняет СК 1 рl6, который кодируется геном-супрессором. СК I р16 инактивирован во многих линиях опухолевых клеток и в клетках «семейной» меланомы.

Особо важную роль в формировании блока G₁/S играет белок р21. Его синтез индуцируется главным клеточным «хранителем генома» — белком-супрессором р53. В свою очередь р53 активируется при возникновении различных повреждений ДИК и, в частности, при гамма-облучении клеток.

В клетках с интактной ДНК содержание р53 исчезающе мало и соответственно ничто не препятствует активации группы генов, необходимых для вступления клетки в фазу синтеза ДНК. У клеток с дефектным или отсутствующим геном р53 контрольный пункт G₁/S неполноценен. Это проявляется в том, что повреждения ДНК, индуцированные ионизирующей радиацией или каким-либо другим способом, не приводят ни к задержке клеток на границе фаз G₁/S, ни к апоптозу. В результате в популяции накапливаются клетки со множественными нарушениями структуры ДНК; появляется и со временем нарастает нестабильность генома, которая ведет к появлению все новых клонов клеток. Их естественный отбор лежит в основе опухолевой прогрессии — постоянного «дрейфа» опухоли к все увеличивающейся автономности и злокачественности. Именно свойство нестабильности генома наделяет клетки опухоли, с одной стороны, замечательной приспособляемостью к условиям окружающей среды и «увертливостью» по отношению к лечебным воздействиям, а с другой — все новыми качествами, в частности, способностью метастазировать.

«Выше» р53 в регуляторной цепи расположен белок, кодируемый геном А73 (ataxia-telangiectasia mutated). Его функция состоит в активации р53 в ответ на повреждение ДНК ионизирующей радиацией. В свою очередь р53 активирует группу генов, продукты которых, по-видимому, «запускают» механизм репарации.

Апоптоз

Апоптоз (программируемая клеточная гибель) — широко распространенный биологический феномен клеточного самоуничтожения, которое индуцируется либо разнообразными внешними стимулами, либо внутренними условиями клетки, невозможностью репарации повреждений ДНК.

Роль апоптоза велика не только в формообразовательных процессах во время эмбриогенеза (формирование органов, замена одних тканей другими, резорбция временных органов и т.д.), но и в поддержании тканевого гомеостаза во взрослом организме.

У опухолевых клеток программа клеточной гибели во многих случаях блокирована, что вносит существенный вклад в увеличение массы опухоли.

Существует два типа клеточной гибели: некроз и апоптоз (клеточное «убийство» и «самоубийство», соответственно), различающиеся как индуцирующими эти процессы стимулами, так и механизмом их осуществления.

Некроз — это метаболическая катастрофа, вызванная тяжелыми повреждениями клеточных структур. Для него характерно раннее увеличение объема клетки и митохондрий с последующим их аутолизом, тогда как внутриядерные изменения обнаруживаются позднее.

Апоптоз как явление физиологическое распространен гораздо шире. С его участием проходят морфообразовательные процессы в эмбриогенезе, позитивная и негативная селекция Т- и В-лимфоцитов, индуцированная глюкокортикоидами гибель лимфоцитов, а также гибель клеток при юс естественном старении. Усиленный апоптоз ведет к инволюции органа, что встречается и в физиологических условиях (например, молочная железа в постлактационном периоде) и при патологии (например, при дегенеративных заболеваниях центральной нервной системы).

Опухолевые клетки имеют селективное преимущество над нормальными, поскольку механизм апоптоза у них зачастую дефектен. Кроме того, у многих из них развивается резистентность к различным химиопрепаратам и к облучению, которые вызывают гибель также по механизму апоптоза. Морфологически апоптоз проявляется вначале в конденсации хроматина, уменьшении объема клетки и фрагментации клеточного ядра, в характерной складчатости плазматических мембран.

Одним из ключевых моментов апоптоза является распад ДНК. Процесс заканчивается фрагментацией клетки с образованием так называемых апоптотических телец, которые быстро фагоцитируются макрофагами или соседними клетками без сопутствующей воспалительной реакции.

Белки, участвующие в апоптозе, подразделяют на две группы в соответствии с их антиапоптическим или проапоптическим действием. Комплексирование проапоптотических и антиапоптических белков ведет, по-видимому, к их взаимному «погашению», поэтому результат (индукция апоптоза или, напротив, его отмена) зависит от «баланса сил». Гибель опухолевых клеток под воздействием химио-препаратов и облучения происходит по механизму апоптоза.

Механизмы опухолевой трансформации

Принципиальное различие между нормальной и опухолевой клетками заключается в том, что переход от покоя к делению (G₀ —> G₁) в первом случае инициируется внешними по отношению к клетке стимулами, а во втором — внутренними. Молекулярные механизмы этого явления сводятся к активации онкогенов и инактивации генов-супрессоров в опухолевых клетках.

Активация онкогенов. 

В середине 1980-х гг. было доказано, что некоторые нормальные клеточные гены обладают онкогенным потенциалом. Так сформировалась концепция онкогена, возникающего из нормального гена (протоонкогена) при его повреждении тем или иным способом. Такая трансформация называется активацией онкогена. Протоонкогены — «акселераторы» клеточного деления. Их функция проявляется как доминантный признак, т.е. становится явной при активации даже одного аллеля (выпадение тормозящей функции генов-супрессоров обнаруживается лишь при утере обоих аллелей).

Возникает вопрос, какие именно гены могут трансформироваться из прогоонкогенов в онкогены? Установлено, что этим свойством обладают гены, участвующие позитивным образом в переносе митогенного сигнала независимо от занимаемого ими в сигнальном пути места (начиная с факторов роста и заканчивая транскрипционными факторами). Число известных протоонкогенов достигает сегодня нескольких десятков и постоянно растет по мере углубления представлений о механизмах клеточного деления. При повреждении какого-либо из этих генов тем или иным способом (факторами физическими или химическими, эндогенными или экзогенными) структура кодируемого им белка может оказаться жестко зафиксированной в процессе активной конформации. Таким образом, в нормальной клетке воздействие внешнего стимула вызывает активную конформацию сигнального белка, которая продолжается лишь до тех пор, пока действует этот стимул.

В мутантной клетке (и в ее клонах) активная конформация белка оказывается жестко закрепленной. Ущербный сигнальный белок «гонит волну возбуждения» вниз по течению (downstream) независимо от состояния вышестоящих структур. Возникает состояние «застойного возбуждения», которое лежит в основе автономного, нерегулируемого деления опухолевой клетки. Приведем несколько примеров. В разных «спонтанных» опухолях человека (рак желудка, мочевого пузыря и т.д.) обнаружена точковая мутация с-Ha-ras-l (одного из представителей семейства ras). Оказалось, что достаточно замены одного основания (соответственно одной аминокислоты в белке), чтобы протоонкоген превратился в онкоген, т.е. приобрел трансформирующие свойства. При этом кодируемый геном c-Ha-ras-1-белок теряет в определенной мере ПФазную активность, поэтому находится постоянно в «возбужденном» состоянии, т.е. в отличие от нормальных клеток, где митогенный сигнал имеет импульсный характер, в клетках с поврежденным ras митогенная стимуляция непрерывна. Такое самоподдерживающееся возбуждение выводит клетку из-под регуляторных влияний организма.

Активация онкогенов может происходить двумя путями — в результате дефекта регуляции их транскрипции или изменения «дозы» гена (при его амплификации), что приводит к избыточному синтезу соответствующего белка, не адекватному месту и времени.

Таким образом, активация онкогена обусловлена нарушением его регуляторной или структурной части.

Инактивация генов-супрессоров. 

Как уже упоминалось, для полной трансформации клетки в подавляющем большинстве случаев недостаточно одной лишь активации онкогена. Бесконтрольному клеточному размножению препятствуют гены-супрессоры. Об их существовании догадывались давно, исходя из двух групп фактов. Во-первых, в опытах по слиянию клеток и образованию гетерокарионов было установлено, что в паре «клетка нормальная + клетка злокачественная» «берет верх» первая (полученный соматический гибрид теряет свои туморогенные свойства). Это свидетельствовало о наличии в нормальной клетке некого тормозящего митотическую активность фактора, отсутствующего, по-видимому, в опухолевой клетке, и о том. что соответствующие гены рецессивны — клетки становятся опухолевыми при утере обоих аллелей. Во-вторых, при цитогенетическом исследовании опухолевых клеток постоянно обнаруживаются делении хромосом, довольно специфические для разных форм рака. Это заставляло думать (и предположение полностью оправдалось), что именно отсутствие соответствующих генов лишает клетку митотических «тормозов».

Например, цитогенетический анализ больных ретинобластомой (злокачественная опухоль сетчатки глаза, характеризующаяся зачастую наследственной предрасположенностью) выявляет характерную для этой формы делению в 13-й хромосоме, где при последующем анализе действительно был идентифицирован ген-супрессор Rb. Наследственная делеция одного аллеля этого гена делает человека предрасположенным к заболеванию ретинобластомой или остеосаркомами.

Гены-супрессоры кодируют белки, блокирующие, каждый своим особым образом, разные этапы митогенной стимуляции (к ним относятся уже упоминавшиеся р53 — главный «хранитель генома», Rb — формирующий механизм «G₁/S checkpoint», p16 и р21, блокирующие активность комплексов cyclin-Cdk, и др.).

Ген-супрессор р53. Особую роль в канцерогенезе играет ген-супрессор р53. Продукт этого гена (белок с молекулярной массой 53 кДа) — регулятор транскрипции, способный активировать одни гены и подавлять другие, дефектен в большинстве опухолей человека, независимо от их происхождения и локализации (опухоли легких, головного мозга, толстой кишки, пищевода, молочной железы, шейки матки, печени, гемопоэтических и ретикулоэндотелиальных тканей и др.). Белок р53 чрезвычайно консервативен (обнаружен у многих представителей животного мира), состоит (у человека) из 393 аминокислот, локализован, как правило, в клеточном ядре.

Функция р53 в нормальных клетках заключается в связывании со специфическими последовательностями ДНК, находящимися в промоторных участках других генов, и в управлении их активностью. Повреждение ДНК нормальных клеток приводит к увеличению содержания р53 и к индукции р53-зависимых белков. Это в свою очередь вызывает задержку клеток на границе G₁/S или к апоптозу.

Во многих опухолевых клетках (возможно, во всех) гены р53 делецированы или мутантны. Мутации по-разному в зависимости от локализации инактивируют р53. Возможны и другие причины функциональной инактивации р53. Например, в результате инфицирования клеток некоторыми вирусами, продукты которых способны взаимодействовать с р53 (такова, по-видимому, одна из причин возникновения рака шейки матки у женщин, инфицированных вирусом папилломатоза человека HPV). К тому же результату приводит продукция в избыточном количестве некоторых внутриклеточных белков, способных связывать р53 и лишать его функциональной активности.

Клетки с дефектами р53 имеют ряд существенных особенностей — резко возрастающую нестабильность генома и дефекты контрольного пункта G₁/S. Таким образом, ключевая роль р53 заключается, по всей вероятности, в поддержании стабильности генома и в индукции апоптоза в случае нерепарируемых повреждений ДНК run неразрешимых внутриклеточных конфликтов. Функциональная инактивация р53 способствует трансформации нормальных клеток в опухолевые, с одной стороны, и прогрессии уже возникшей опухоли — с другой.

«Как в сцене из дантова «Ада» рождаются эти уродливые клетки среди распадающихся останков своих предков, неуязвимые и благополучные в условиях, совершенно пагубных для простых смертных… Глухие к нормальным клеточным регуляторам, они бесконтрольно размножаются и постоянно увеличивают степень своей ненормальности благодаря амплификации генов и хромосомным перестройкам. Это только вопрос времени, когда они выберутся из своего обиталища, проникнут в окружающие нормальные ткани и нападут на своих невинных соседей…» (К. Кинцлер, Б.Вогельштейн; K.KinzIer, В. Vogelstein, 1996).

Ген-супрессор ЛРС (Adenomatous Polyposis Coli).

 Этот ген-супрессор часто дефектен при синдромах семейного аденоматозного поли поза и наследственного неполипозного рака толстой и прямой кишки. В толстом кишечнике пациентов с наследственными мутациями АРС во II —III декаде жизни возникают тысячи аденоматозных полипов, часть из которых могут дать начало опухоли (вторая по значимости причина онкологической смертности в США).

АРС — первый из белков-супрессоров, которые наделяют особой функцией «сторожа» (gatekeeper), обеспечивающего тканевый гомеостаз.

Эти белки ответственны за постоянство числа клеток в постоянно обновляемых тканях и за адекватность клеточных реакций в ситуациях, требующих роста ткани (например, при ее развитии или травме). Повреждение «сторожа» приводит к нарушению тканевого гомеостаза из-за дисбаланса клеточной гибели и пролиферации. Ген с подобной функцией находится в уникальном положении — его нарушение инициирует пролиферацию и, если последуют мутации других генов, рост опухоли. Напротив, повреждения иных генов при нормальном «стороже» не могут иметь никаких последствий. Отсюда следует, что определяющим для канцерогенеза может оказаться не простое накопление мутаций в тех или иных генах, а порядок появления этих мутаций. Если уже первая из них затрагивает АРС, 70 последующие канцерогенные события весьма вероятны, поскольку дефектные клетки размножаются. увеличивая «базу» для последующих мутационных событий. Напротив, если первичные события затрагивают другие гены, то функционально активный «сторож» срабатывает, не позволяя этим клеткам делиться и индуцируя их апоптоз.

Гипотеза «сторожа» возникла как результат анализа мутационного процесса при колоректальном раке человека и животных, выявившего повреждения АРС на самых ранних стадиях канцерогенеза (уже на стадии микроскопических узелков), тогда как мутации других генов (в частности, RASnpSS) возникают значительно позже. Кроме того, мутации р53 обнаруживают в клетках тканей, видимым образом не измененных. Это дает основание для предположения, что онкогенный потенциал мутаций может проявиться только на фоне дефектного АРС, который играет определяющую роль в инициации рака, тогда как дефекты других генных продуктов (онкогенов и супрессоров) — в его прогрессии. Предполагается, что роль «сторожа» в разных тканях исполняют разные гены.

Нарушения механизмов репарации Днк.

Инициация и прогрессия опухоли — это фенотипические проявления повреждений генотипа (ДНК). Повреждения ДНК различны при химическом мутагенезе, ультрафиолетовом облучении, при воздействии ионизирующей радиации. Соответственно этому существует и несколько типов репарации, которые выполняют очень важную защитную функцию. При некоторых наследственных синдромах (пигментная ксеродерма, синдром Линча и др.) механизмы репарации неполноценны. В результате у таких больных развиваются множественные опухоли разных тканей.

Таким образом, в области экспериментальной онкологии сделаны фундаментальные открытия, значительно продвинувшие нас в понимании не только того, как нормальная клетка трансформируется в опухолевую, но и как она функционирует, рождается и погибает.

Менее существенны достижения в лечении злокачественных новообразований. Не удалось пока выявить такие биохимические особенности опухолевых клеток, которые позволяли бы, с одной стороны, идентифицировать процесс на самых ранних, еще доступных лечению стадиях его развития, и, с другой стороны, найти ту «магическую пулю», которая избирательно поражала бы злокачественные клетки, не затрагивая нормальные. Вместе с тем есть основания для осторожного оптимизма. Во-первых, становятся все более эффективными профилактические мероприятия, способные резко снизить онкологическую заболеваемость (профилактика курения, алкоголизма, других вредных привычек, экологические мероприятия, улучшение условий труда). Наряду с классической триадой (хирургия, химиотерапия, облучение) для лечения онкологических больных начинают применяться принципиально новые методы — иммунотерапия и фотодинамическая терапия, а также биотехнологические подходы, направленные на активацию в опухолевых клетках генов-супрессоров и проапоптических генов. Весьма обнадеживающие результаты получены в поиске препаратов, блокирующих формирование сосудистого ложа в опухолевой ткани. Принимая во внимание быстрый прогресс во всех этих направлениях, можно ожидать ощутимых практических результатов уже в ближайшем будущем.

Контрольные вопросы

1. Что такое опухоль?
2. Чем отличается доброкачественная опухоль от злокачественной?
3. Какие факторы способствуют образованию опухоли?
4. Какие этиологические факторы канцерогенеза вам известны?
5. Какие существуют стадии развития опухоли?
6. Какие свойства отличают опухолевые клетки от нормальных?
7. В чем выражается системное действие опухоли на организм?